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高彩霞研究組與李家洋研究組合作在作物基因組編輯育種技術方法研究中取得新進展

  遺傳與變異是物種進化的基礎。通過物理、化學方法(如輻射誘變、EMS誘變)産生全基因組的隨機突變已經成爲農作物育種的常規手段,但其中具有新型農藝性狀突變體的篩選較爲費時、費力。定向進化(Directed Evolution)則通過創制目標基因的突變文庫,在施加一定選擇壓力下能夠快速獲得目的突變體。目前,植物基因的定向進化通常先通過易錯PCRDNA合成或DNA重组等方法在体外产生目标基因的突变文库,再转化到大肠杆菌或酵母中进行功能筛选。然而,由于离开原始的基因组和细胞环境,筛选出来的基因突变可能并不能完全反映出它在植物中的真实功能。更重要的是,大多数重要农艺性状无法在大肠杆菌或酵母中进行筛选。因此,建立一种在植物原位进行基因饱和突变和功能筛选的定向进化新方法将有助于加快植物育种及重要功能基因研究的进程。近日,中國科學院遗传與发育生物学研究所高彩霞研究组和李家洋研究组合作,构建了新型的饱和靶向内源基因突变碱基编辑器STEME,並在植物中實現了基因的定向進化和功能篩選。 

 

  研究者將胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A和腺嘌呤脫氨酶ecTadA-ecTadA7.10同時融合在nCas9 (D10A)N端,並將抑制體內尿嘧啶糖基化酶UDG的活性的UGI以融合或自由表達的形式置于nCas9 (D10A)C端,共構建了4種形式的雙堿基編輯器STEME (STEME-1STEME-4)STEME雙堿基編輯器均可以只在一個sgRNA引導下就可以誘導靶位點C>TA>G的同時突變,顯著增加了靶基因堿基突變的飽和度及産生突變類型的多樣性。STEME-1在水稻原生質體中C>T誘導效率高達61.61%C>TA>G同時突變的效率也高達15.50%。爲了提高靶基因的堿基覆蓋度,研究者進一步利用能夠識別NG PAM的變體Cas9-NG構建了第5個雙堿基編輯器STEME-NG,發現只需要20sgRNA就可以對OsACC上編碼56個氨基酸的序列实现近饱和的突变。 

 

  爲了展示STEME在植物中的定向進化能力,研究者設計了靶向OsACC羧基轉移酶結構域上400個氨基酸编码序列的200個独立的sgRNA,分別構建到STEME-1STEME-NG雙元載體上。將構建好的雙元載體分爲27個转化组,每個组内混合了等分子量的411sgRNA載體,覆蓋80-142 bp的靶DNA區域,便于提高轉化效率和突變的高通量測序。經農杆菌介導法轉化水稻愈傷,共獲得約6000株水稻再生苗。水培法煉苗10天後,對再生苗噴灑高效氟吡甲禾靈(Haloxyfop)进行筛选,共发现四個除草剂抗性突变位点:P1927FW2125CS1866FA1884P。除W2125C以外,其余三個抗性位点未曾在植物中有过报道。其中,P1927FW2125C突變一樣表現出強除草劑抗性,具有較高的生産應用潛能。基于同源蛋白結構模型分析發現,這些氨基酸突變直接或間接地影響了除草劑結合口袋的構象,從而降低了其對除草劑分子的結合能力而獲得除草劑抗性。 

 

  STEME技術體系的建立,對于原位(In situ)定向進化植物的內源功能基因提供了新型技術支撐,對農作物分子設計育種具有重要意義。此外,STEME系統還有望應用于不同細胞系、酵母或動物中的非編碼區的順式作用元件的調控、動物致病SNV的修正和抗藥位點的篩選等。該研究成果于20200113日在線發表于Nature Biotechnology雜志(DOI:10.1038/s41587-019-0393-7)。高彩霞研究组博士生李超、助理研究员张瑞以及李家洋研究组副研究员孟祥兵为本文共同第一作者,高彩霞研究员和李家洋研究员为共同通讯作者。遗传发育所陈宇航研究组和微生物研究所邱金龙研究组参與了部分研究工作。该研究得到中國科學院战略性先导专项、国家自然基金委等项目的经费资助。 

    

圖:(a) STEME介導的雙堿基(C>TA>G)編輯策略。(b) STEME-1介導的堿基編輯産物類型分布。(c) 利用STEME系統飽和突變OsACC CT結構域流程圖。(d) STEME系統介導的OsACC氨基酸替換産生除草劑抗性。